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蛋白染色技术的新进展

作者:编译 樊慧俐 时间:2009-10-13 14:43:40 来源: 生物技术世界

       在对蛋白质进行鉴定、纯度及完整性的分析中,电泳技术是常用的分析技术。早期电泳技术得以快速发展的一个重要原因就是完成聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后,存在一种灵敏与可靠的方法使蛋白可视化。随着时间的推移,考马斯亮兰(Coomassie Brilliant Blue)染色已经成为广泛接受的蛋白胶检测方法。
考马斯亮兰R-250及其二甲基化的衍生物G-250,被用于蛋白胶染色已长达45年之久。这些年来,增强敏感性方面的改进从未停止,考马斯亮兰染色已经可以满足下游质谱分析的需要。考马斯亮兰染料成本相对较低,制备方法成熟,检测的敏感度在5~50ng的范围,标准的白光透射器就可以观察检测,染色和脱色经得起时间考验,这些特点成为考马斯亮兰被人们广泛接受的原因。
       虽然早已被广泛接受和应用,但考马斯亮兰染色并不是PAGE电泳图中蛋白条带可视化的最佳方法。考马斯亮兰为何能结合在蛋白上具体机制也还不清楚。人们也早就发现,考马斯亮兰对不同蛋白质的结合能力是不同的,一部分原因是:考马斯亮兰对富含精氨酸、组氨酸及赖氨酸的蛋白质亲和力较强。此外,糖蛋白很难被考马斯亮兰染色,而且,有文献报道考马斯亮兰染色后检测到的蛋白含量比真实水平要高。不同的操作者同时进行实验,结果可能会因人而异。再者,考马斯亮兰染色需要至少两个小时的时间,在此过程中可能残留大量的溶剂杂质,不利于随后的Western印记杂交实验。

改进配方
        近几年来,针对考马斯亮兰染色法存在的两个主要问题:使用有毒或有刺激性的溶液及染色脱色过程比较耗时,已经有了解决的方案。传统的方法要求在染色及脱色的过程中用甲醇或乙酸等物质,这两种物质对人体是有害的。现在已经可以从市场上买到它们的替代品,如Bio-Rad公司的Bio-Safe及Invitrogen公司的Simply BlueTM safestain,这些替代品可以与传统的配方发挥相同的功能,但却避免了使用甲醇和乙酸,同时也不会产生有害的废弃物。利用Thermo Fisher公司的Imperial蛋白(一种改进配方的考马斯亮兰R-250),可以在短短二十分钟的时间内检测到很微量的蛋白质(6ng),检测过程也不会用到甲醇和乙酸。这些商业化的配方同时也可以略去染色-脱色过程中的冗余步骤,从而减少了操作的时间及不同用户操作所带来的差异。传统及新的配方都可以用微波的方法,这样便可以将总的处理时间压缩至一个小时甚至更短。

增强敏感度
        现在,考马斯亮兰染色所能提供的灵敏度已经不能满足人们的需求,研究人员越来越需要更高的灵敏度来检测PAGE凝胶中的蛋白质,尤其是对于研究蛋白组学及双向电泳中蛋白混合物。能够满足此需求的第一代技术是银染法,只需要提供0.25~0.5ng的待检测蛋白质即可,同时也不需要其他成像设备。Bio-Rad公司的Dodeca Silver Stain试剂盒满足了高通量染色的需求,而Invitrogen公司的SliverQuest Silver Staining试剂盒可以帮助用户在90分钟内观察到实验结果,如果用微波程序的话,只需要30分钟的时间。这两种试剂盒均能满足随后质谱分析的要求。然而,银染法与操作者的技术手法是密切相关的。
        荧光染料法可以将灵敏度提高到1ng,并扩展了动态检测范围。使用最广泛的是Invitrogen公司的SYPRO® Ruby,它具有三个数量级的线性定量范围。Bio-Rad公司的Flamingo采用两步法检测,灵敏度更高,可达0.5ng或更低。通用电气医疗集团生命科学部生产的Deep Purple,在进行检测时,背景干扰很小。所有这些荧光染色法都是与最后进行的质谱分析相匹配的,但它们至少需要一个紫外光透射器才能观察,而且,有激光扫描仪时效果更佳。当然,每块胶的成本都会比用考马斯亮兰染色时高。

功能多样化
        考马斯亮兰是一种普通的蛋白染料,它不能区分不同类型的蛋白质之间的差异,例如磷酸化的蛋白与糖蛋白。Invitrogen公司的Pro-Q Diamond和Emerald系列的荧光染料能够解决这一问题。Diamond系列的磷酸化蛋白质染剂可以选择性的对含有磷酸化基团(连接在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上)的蛋白质染色,操作方便快捷,4~5小时便可以看到染色结果。此染料也能满足后续质谱分析的需要,而且每条带上磷酸化蛋白的损失量仅仅16ng。如果与SYPRO® Ruby结合使用,则可以将磷酸化程度较低但高丰度的蛋白与磷酸化程度较高但低丰度的蛋白质区别开来。Emerald糖蛋白染料也可以与SYPRO® Ruby结合使用,以鉴别凝胶中的蛋白是否含有葡聚糖。

替代的成像技术
       通过三卤化合物修饰色氨酸,发明了一种新的蛋白可视化技术。该技术克服了考马斯亮兰染色的四处不足:实验耗时、结果因人而异,重复性差、使用刺激性的有害溶液及不便于后续Western杂交实验。该技术利用标准的样品制备,试剂和电泳方法,同时将三卤化合物添加到按标准方法配置的凝胶中。电泳结束后,将凝胶置于紫外光下照射,这样就可以激活三卤化合物与凝胶中蛋白质上色氨酸残基之间的共价反应。反应生成的色氨酸经相同的紫外光照射时就会发出荧光。此原理使得该技术便于自动化,具体体现在Rio-Rad公司的Criterion Stain Free Imaging成像系统上。凝胶只需被照射2.5秒即可激发共价反应,几分钟过后便可通过检测器检测到荧光信号,进而得到凝胶中蛋白的图像。可以通过自动化程序计算出每个条带所代表的蛋白质的分子量和质量。从电泳分离到凝胶成像的整个实验只需一个小时便可完成。
       聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白条带的可重复定量依赖于检测方法的质量及可靠性。不稳定的考马斯亮兰染色可能会导致对凝胶中蛋白条带的错误定量,而紫外激发的凝胶成像系统则结果可靠,背景干扰少且可重复性强。对于很多蛋白,利用紫外激发的灵敏度可以与考马斯亮兰法相抗衡或比它更好(检测量仅需0.2~5ng)。在一项研究中,Criterion Stain Free成像系统所表现出来的变异系数(Coefficient of variation,CV)仅为7.8%,而传统的考马斯亮兰染色的却高达19.7%。几乎所有的生物体中,只有不到10%的蛋白质(分子量在10~260kD)缺少色氨酸,所以紫外激发技术对大部分蛋白质是很有效的。事实上,人体内分子量大于10kD的蛋白质中,缺少色氨酸的还不到7.3%。紫外激发成像技术可用于分析很多不同来源、不同类型的蛋白质,成像结果与考马斯亮兰染色法相差无几。该成像技术也可以满足后续Western杂交分析的要求。当使用多克隆抗体时,紫外激发并不会影响人体两种蛋白之间的转移或免疫检测。在有或没有在外光照射凝胶时,检出限及信号的强度是相同的。同时,在凝胶中,通过紫外诱导的方式将蛋白中的色氨酸残基进行修饰,也不会影响后续对该蛋白的质谱鉴定和分析。

结 论
      现在,市场上有很多替换的配方或荧光染料可以帮助克服“考马斯亮兰”的缺点,从而达到使用方便、节约时间、而且灵敏度更高的要求。而新的成像技术又可以在电泳结束后数分钟的时间内提供图像结果,灵敏度与考马斯亮兰染色相差无几,但实验结果更可靠,重复性更强,而且能满足后续Wsetern杂交及质谱分析的要求。
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