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作者:Michele Pagano 译 魏荣瑄 时间:2009-08-11 来源: 生物技术世界

简单的清除——泛素化系统
       我非常幸运地研究明晰直观的细胞过程,即泛素蛋白酶体系统(UPS)。在这类蛋白体上,许多酶将泛素分子链连接于其他蛋白质,便于蛋白酶体降解它们。研究这种降解的美感在于,研究者可以检测蛋白质最初显现以及随后消失的过程。这是一种快速反应过程,瞬时即可消除大量蛋白质,它可以将特异诱导的蛋白质降解作用定位于亚细胞器的一定部位,而不与其他分子接触。最后,UPS拥有成千上万的酶和各种成分,因此在选择靶点时特异性非常高,所谓靶点就是泛素连接酶族,是真核生物最大的酶族。这一系统在复杂性和重要性方面堪与磷酸化匹敌,但是没有干扰背景,亦即没有噪音,没有阴性结果的阴影。
       我把细胞想象成分子机器网络,彼此之间同步性极佳。这些机器的各种齿轮(例如细胞酶类)必须出现在合适的时间,完成功能后便消失。在某种意义上,泛素蛋白水解所行使的调节作用是最确定的、最精细的调节系统,没有可逆转的修饰,只是简单的清除。

研究系统的主角——泛素
        1990年,我迁到德国的欧洲分子生物学实验室(EMBL),在Giulio Draettad的指导下做博士后研究。在这里我开展细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的工作,这些激酶通过使一些重要调节蛋白磷酸化的方式驱动着细胞分裂周期。据报道,细胞中CDKs的构建起着控制细胞进入有丝分裂期的作用。但是,Giulio以前只是发现,有一个被细胞周期蛋白A激活的CDK,可以保持数小时的活性。由于我有研究磷酸化的经历,我开始研究这一问题,结果证明细胞周期蛋白A可以对S期进行调节,这一时期细胞中DNA进行复制,为细胞分裂作准备。我决定通过抑制剂p27研究CDKs的调节。P27是新近发现的一种分子,我似乎感觉它的竞争性有点低,因为大多数研究细胞周期的实验室那时都聚焦在CDK抑制剂p16和p21上。
       首先,我要观察细胞周期各个时期p27的水平。我观察到p27的水平因细胞周期时相而改变。在细胞静止期,p27水平很高,在G期开始下降,此时细胞处在分裂时期,正准备复制其基因组所需的设施,对营养物和生长因子均有所反应。但是,当我检测p27编码基因的表达时,我注意到此基因的mRNA水平,以及蛋白质的翻译,在整个细胞周期中都保持恒定。那么,如果细胞以不变的速率不分时间地产生p27,又如何解释细胞周期不同时间产生的相应蛋白水平有所不同呢?于是不得不归结于发生了降解。对p27蛋白的半衰期测量结果表明,p27的确是在细胞周期的关键时期被降解掉了,此时为了进入随后的S期,就需要激活CDK。
        那时,研究者还不知道泛素在降解细胞重要调节子方面起着核心作用。过去人们认为,蛋白质渐渐老化,以致被氧化、失去折叠状态、受损、最后被诸如溶酶体一类的细胞器降解,如此而已。自从以色列理工学院Avram Hershko及其同事发现了泛素系统之后,人们才认识到蛋白质水解作用不仅是一种熵变过程,而且是能量依赖的可调过程。然而,许多科学家多年来都把泛素系统看作是一种蛋白质(特别是半衰期短的蛋白质)水解所需的特化途径。
Hershko'小组在上世纪80年代早期对泛素附着于蛋白质的通用机制进行了特征鉴定。这是一个三酶参与过程。E1酶(酶1)对泛素分子进行结合和“活化”,并将这些分子转移至有E2酶族(或称Ubc,一族泛素结合酶)中的一种。在E3族(又称泛素连接酶)一成员的帮助下,E2的每一成员将一条泛素链同即将降解的蛋白质结合在一起。最后,E3通过将这些特异蛋白转移至E2的方式,赋予整个系统以特异性。
        我似乎觉得泛素可能是我所研究的系统中的主角,但是还有一些其他候选者。在酵母双杂交系统中,它们好像都参与其中。我的研究组发现了称作泛素结合酶9(Ubc9)的蛋白质,它能同p27的C端相互作用。我深受这一结果鼓舞,设计了一离体系统,用以确证P27是由泛素加以标签而被降解的。我们当时的确不知道Ubc9在双杂交实验中通常呈现假阳性!幸运的是,这种人为的结果(未发表资料)却歪打正着地使我们走入一正确方向。我们的离体系统表明,p27真的被泛素化了,当然,不是被Ubc9,而是被Ubc3泛素化。
         我们这篇论文引起广泛注意,部分原因是,它证明了泛素系统在控制哺乳动物细胞周期方面具有全新的功能。1996年,我迁到纽约大学医学院,开始研究员的职业生涯。在那里最初的一项研究课题是同Massimo Loda合作进行的,他是Dana Farber癌症研究所的癌症病理学家,这项研究旨在探明p27在人类癌症中的作用。
F-盒蛋白是一个大族,它给我提供了一个难得的机会,使我得以享受研究复杂的、至关重要的各种不同细胞过程的乐趣。
        我们对p27的了解表明,它应该是一种癌症抑制剂,但是却没有人能提供有关的遗传证据。然而,如果把研究目标瞄准在降解方面,而不是对准基因表达,那么就会推动对细胞中p27丰度调节的认知。于是,我们研究了II期结肠癌的蛋白质水平。选择II期作为研究对象的原因是,我们知道有些病例发展缓慢,而有些病例却扩散得很快。对这些样品的p27水平进行比较,再观察患者的病情演变,结果显示p27水平越低,癌症的扩散就越慢。自此以后,不少研究者用p27作为其他类型癌症的一种诊断标记。重要的是,我们在同一项研究中看到,在有些扩散性癌症中,p27水平较低往往是由于它的降解能力提高了,而并非出于转录和翻译水平的下降。
后来,我醉心于研究细胞中泛素究竟有多大影响这一问题。例如,在细胞分裂的每一步,泛素蛋白酶系统会除去控制前一步的所有的酶和因子,而为新的酶和因子(诸如细胞周期蛋白)腾出空间,使其得以积累,以便细胞周期只能向前迈进。我们知道,p27可以被泛素蛋白酶系统降解,但是,是什么东西赋予泛素蛋白酶系统特异性,令它恰恰在细胞周期的合适时间将p27降解呢?

研究的乐趣——F盒蛋白
       其他研究组的结果表明,在酵母中,Ubc3对称作SCFs的E3酶复合物很有效。SCFs复合物由三个亚基构成,即Skp1, Cul1和诸多F盒蛋白中的一种。其中,盒蛋白赋予E3 降解特异性。我们认为,如果能发现人类所有的F盒蛋白,我们离了解p27的控制因素以及细胞其他许多蛋白的降解就会更近一步。
1997年和1998年期间,我的实验室用酵母双杂交系统和人Skp1做诱饵,钓取人的F盒蛋白。应用这种技术以及计算机推测,我们鉴定出26种F盒蛋白。1998年夏,Avram到我的实验室作学术研究,着手研究p27降解之谜。我们发现,一种称作Skp2的F盒蛋白能特异地结合p27,启动其泛素化。在时序上,这一事件至少部分地受Skp2状况的左右,在细胞静止期Skp2的水平较低,而在G1末期有所提高。
        虽然Skp2的结果很重要,但是当我们用纯化的组分蛋白试图离体重复p27泛素化时却失败了,后来在反应中加入了细胞粗提取液才获得成功。这说明我们的离体试验缺乏细胞提取液的某种必要成分。Avram根据他在蛋白质纯化研究中的经验,对细胞提取液进行了分离,以便找到缺失的成分。他找到的这种蛋白质就是Cks1,其实我们已经知道它能结合CDKs,但是不了解其生化功能。最终,我们同纽约纪念史隆基达宁癌症中心(the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center )的Nikola Pavletich实验室进行合作,获得了Skp1-Skp2-Cks1-p27复合物的晶体结构,为我们了解SCF的催化机制提供了重要思路。
        我们已经获得了调节p27降解的全部蛋白。但是,是什么调节Skp2和Cks1的功能和状况?我们陷入这一问题之中,寻找着所有通过调节Skp2和 Cks1而影响p27降解的蛋白质,即既能作用于Skp2,也能作用于其他位于Skp2和Cks1上游的效应蛋白。与此同时,我们开始对第二个F盒蛋白βTrCP进行特征鉴定。我们发现,βTrCP既能用作Cdk1活性的抑制子,也能用作 Cdk1的激活子,这要视细胞周期的时相而定。
在人类基因组资料发表之后,我们就可能简单的对基因组进行扫描,以寻找同源序列,于是F盒蛋白的数目一下子由26个跃升为69个。我们和其他人只找到了其中9个的底物。到了2005年,虽然我们并非有意结束对受Skp2和βTrCP调节的细胞周期每一细节的鉴定工作,但也开始对仅仅研究细微末节兴趣不大了。于是,我们决定集中研究那些罕见的蛋白,它们的功能虽然还不清楚,但是有迹象表明,它们在细胞增值或细胞周期的检验点方面可能起某些作用。研究计划的第一部分是确立鉴定罕见的F盒蛋白底物的方法。
        依历史经验看,从底物着手鉴定F盒蛋白,比反过来由特异F盒蛋白寻找其底物,要容易得多,我们正是用p27鉴定Skp2的。我们及其他人未发表的负结果表明,用于鉴定蛋白质相互作用的标准途径,例如酵母双杂交系统,在寻找F盒蛋白底物方面或许不会成功。
我们研究出一种免疫纯化技术,它可以使泛素化底物富集起来,其基础是,SCF连接酶可以启动离体条件下被结合底物的泛素化,然后再对泛素化的蛋白质进行选择性纯化。为了完成分析,我们选择了βTrCP,主要原因有二:一是βTrCP 的一些底物已经知道,这有助于估评我们方法的可行性和效果。第二,一个经过鉴定的βTrCP结合基序的存在可能有助于新底物的鉴定。
       通过对方法的测试和优化,我们已发现一些新的βTrCP底物,这些底物并不参与细胞周期的控制。这里有两个令人惊奇之点:一是βTrCP控制称作PDCD4的蛋白质的降解,这种蛋白质是蛋白质合成的抑制剂;二是发现了诱导细胞死亡的强力因子BimEL。我们发现,在对有丝分裂源刺激的反应中,这两种蛋白都经由βTrCP被降解,以便使蛋白质合成得以进行(因此细胞能够生长),同时使细胞能够存活。我们还鉴定出一种转录抑制剂REST,这是βTrCP的一种新底物,也需要被降解掉才能使“基因组护卫者”Mad2的转录得以进行。
       我们看到,一些F盒蛋白同多种底物的蛋白水解反应相互协调,而其他一些蛋白则具有非常特异的功能,仅仅决定着一两种蛋白的泛素化。例如有些F盒蛋白同生物钟主要调节子的降解密切相关,另一些也控制着一些后调机制。
我们所取得的清晰的蛋白质组学图像,远远超过原先我们对细胞周期演变过程中调节的认识。随着更多的罕见F盒蛋白生物功能的鉴定,这一迷人系统的面目无疑将会更加令人兴趣盎然。
       本文作者Michele Pagano,曾在欧洲分子生物学实验室(EMBL)工作,现任纽约大学医学院研究员。
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